七百八十一.裂
【後天或者元旦完結】
?有很多研究發發現晝夜節律相關因子的失調與NSCLC的複發和轉移有關，因此識別出晝夜節律相關因子也是目前臨床所需要的。該研究發現，HLF在早期複發的NSCLC組織中顯著降低，與NSCLC患者的早期進展與遠處轉移顯著相關。並且上調HLF可抑制肺定植，而沉默HLF可促進體內NSCLC細胞向骨、肝和腦的轉移。
?機制：下調HLF促進非錨定的NSCLC細胞在低營養條件下的無氧代謝，通過PPARα和PPARγ轉運、激活NF-κB/p65信號通路，基因的缺失和甲基化均有助於下調NSCLC組織中的HLF的表達。HLF有可能成為臨床干預NSCLC的新靶點。
?雖然多種治療策略對原發性非小細胞肺癌的治療具有良好的前景，但由於其早期複發和廣泛的轉移潛力，非小細胞肺癌仍然是癌症相關死亡的主要原因。
?從名字上說，晝夜節律相關分子由一系列的時鐘基因和蛋白質組成，在睡眠周期的調節中發揮着重要作用。越來越多的研究報道，晝夜節律相關調節因子的失調通過不同的機制與腫瘤的發生和轉移有關。近年來，生物鐘基因在NSCLC中的作用得到了廣泛的關注。例如，在肺腺癌中，過表達CRY2、BMAL1和RORA聯合下調TIMELESS和NPAS2的表達與預后良好相關，而DEC1和TIMELESS高表達預示著在鱗狀細胞NSCLC中較差的總生存率。
?通過分析來自癌症基因組圖譜(TCGA)的NSCLC數據集中的多個晝夜相關調控因子和我們之前來自Array表達(AE-meta)的整合RNA表達譜，在目前的研究中，我們辨認出了一個晝夜基因——肝白血病因子(HLF)，它是脯氨酸和富含酸性氨基酸的鹼性亮氨酸拉鏈轉錄因子家族(PARbZIP)的成員，在早期複發的NSCLC組織中顯著減少，這與NSCLC患者的早期進展和遠處轉移顯著相關。
?來自TCGA的NSCLCRNA測序數據集，我們發現與相鄰正常組織(ANT)相比，NSCLC組織中HLF的表達水平顯著降低。通過分析來自TCGA的NSCLC數據集，與非複發的NSCLC組織3年內未複發，n=72）相比，HLF也是早期複發的NSCLC組織（一年內複發，n=72）中所有晝夜節律相關調節下調因子之一。
?我們之前基於AffymetrixU133Plus2.0晶片(AE-meta)結合TCGA分析的NSCLC整合數據譜的結果進一步表明，NSCLC組織中HLF的表達顯著下調，並且在早期複發的NSCLC組織中進一步減少（補充圖A，B）。
圖片?Real-timePCR和Western印跡分析顯示，與匹配的ANT相比，7/10對NSCLC組織中HLF的mRNA和蛋白水平降低(圖1C和D）。
?Westernblot分析配對NSCLC組織中HLF蛋白水平與配對ANT的比較。α-微管蛋白作為負載控制。
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?1年複發NSCLC組織(n=5)與3年非複發NSCLC組織(n=5)的HLFmRNA表達和蛋白水平。轉錄水平歸一化為GAPDH表達，
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?此外，與非複發NSCLC組織相比，早期複發NSCLC組織中HLF表達顯著下調（圖1E，F）。
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?不同亞型NSCLC及良性肺疾病組織中HLF免疫組化染色的典型圖片（圖A）。惡性NSCLC組織和良性肺組織中HLF不同免疫組化染色指數的病例數(良性肺組織，n=64;ADC，n=204;SQC，n=112;非小細胞肺癌其他亞型，n=26)（圖B）。與TCGA(ANT)(ANT、=109、ADC、=511、SQC、=502)相比，ADC和SQC中HLF表達下調（圖C）。來自TCGA和AE-meta的NSCLC數據集證明了這一點（D，E）
?-Meier生存分析進一步顯示，與高HLF表達的NSCLC患者相比，低HLF表達的NSCLC患者的無進展生存期更差(圖2F)，這與TCGA、AE-meta和K-MPlotter分析結果一致(圖2G-I)。
?同樣，在低HLF表達的ADC和SQC患者中觀察到較短的無進展生存期(圖2J-Q)。
以上結果說明，低表達HLF與NSCLC的晚期臨床病理特徵和早期進展相關。
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?此外，HLF的表達水平隨着臨床分級和階段（補充圖1G–I）的提高而逐漸下降(補充圖1E，F）。
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?我們首先將NSCLC患者分為I級至III級和I級至IV級的不同亞組，如補充圖2A-F所示，在相同病理分級下，低表達HLF的NSCLC患者的無進展生存期較高表達HLF的患者短。相應的，根據多個獨立數據集，包括我們的樣本(補充圖2G和H)，TCGA（補充圖2I和J），AE-Meta(補充圖2K和L)和K-MPlotter(補充圖2M?O)，在相同臨床階段的NSCLC患者中也有類似的發現。
?綜上所述，我們的研究結果表明，低表達HLF與NSCLC患者的早期進展和晚期臨床病理特徵顯著正相關。
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?進一步研究發現，在NSCLC患者中，HLF下調與較短的局部無複發生存期和遠處無轉移生存期呈正相關(補充圖3A-D)。同樣，低表達HLF的ADC患者以及SQC患者(補充圖3I-L)的局部無複發生存期和遠處無轉移生存期較差(補充圖3E-H)。以上結果說明，低表達HLF促進NSCLC早期局部複發和多器官遠處轉移。
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?為了進一步確定HLF在NSCLC細胞局部肺定植和遠處轉移中的作用，首先在多個不同亞型的NSCLC細胞株中檢測了HLF的表達。
?如補充圖4A和B所示，與非癌永生化肺支氣管上皮細胞BEAS-2B和正常肺成纖維細胞WI-38相比，NSCLC細胞中HLF的mRNA和蛋白質水平差異下調。我們進一步構建了HLF過表達的NCI-H1975(H1975)和NCI-H520(H520)肺癌細胞，這些細胞表達所有NSCLC細胞系中HLF水平最低，並內源性下調NCI-H460(H460)和NCI-H1299(H1299)細胞HLF的表達，這兩種細胞均表達最高的內源性HLF水平(補充圖4C和D）。
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?採用小鼠尾靜脈模型研究NSCLC細胞的肺定植和生長能力。如圖3A-D和補充圖4E，上調HLF顯著抑制H1975細胞在肺中的腫瘤發生，表現為肺結節的形成減少，每m㎡的癌細胞數量減少，累積生存率延長。相反，沉默HLF對H460細胞有相反的效果(圖3A-C、E和補充圖4E)。
?值得注意的是，HLF表達的改變不僅影響大肺結節的形成(在分析的腫瘤切片中定義為>50腫瘤細胞)(圖3B)，但也影響小肺結節的形成(在分析的腫瘤切片中定義為5-50個腫瘤細胞)(補充圖4E)，這支持了HLF在腫瘤細胞的早期定植和隨後的肺內生長中都起着重要作用的觀點。谷
?最後，與實驗結束時相比，在注射HLF穩定過表達的H1975細胞和下調H460細胞的小鼠腫瘤組織中，進一步證實了相應的高和低表達水平(補充圖4F)。
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?然後，採用體內左心室接種小鼠模型檢測HLF對NSCLC遠處轉移能力的影響，將載體/NCI-H1975、HLF過表達NCI-H1975、載體/NCI-H460和HLFsh#1/NCI-H460細胞接種到小鼠左心室。
?接種細胞6周后，收集小鼠的脛骨、腦、肝組織，並進行H&E染色處理。如圖所示。圖3F-I和補充圖4G，我們在與載體組相比，過HLF表達小鼠組中，包括骨、大腦和肝臟等遠處器官檢測到較少的轉移性腫瘤，以及較長的累積存活期延長。
?相比之下，沉默HLF可顯著增強骨、腦和肝臟轉移瘤的形成，並縮短生存期(圖3F-I和補充圖4H)。
?因此，這些結果表明，低表達HLF的NSCLC細胞具有更強的局部定植和生長能力，以及更強的遠處轉移能力。
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?我們利用CCK-8、集落形成和An連接素凋亡進一步研究了HLF在NSCLC中的生物學功能，發現在正常培養條件下，HLF對NSCLC細胞的增殖和凋亡能力沒有顯著影響(補充圖5A–C)。
?我們的結果顯示，上調HLF會增加培養液的PH水平，而沉
默HLF會降低培養基的pH水平，但正常情況下HLF並不影響NSCLC細胞的表型和數量(補充圖5D)。
?低表達HLF可能通過營養代謝途徑促進NSCLC細胞對低營養狀態的適應，因為即使在正常的含氧條件下，癌細胞也更傾向於通過厭氧途徑代謝。
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?然而，上調HLF抑制NSCLC的生長，而沉默HLF可促進NSCLC細胞的錨定和懸浮生長能力(圖4A和B)，表明沉默HLF增強了NSCLC細胞在懸浮條件下的生存能力，即anoikis耐葯。這是各種癌症中與遠處轉移有關的轉移性癌細胞的主要特徵。
?事實上，晝夜節律基因的失調導致了NSCLC的代謝失調，HLF廣泛參與了多種物質代謝過程，包括脂質和氧化代謝。
?在低血清(1%)和低葡萄糖(1g/L)培養液組成的低營養條件下，HLF過表達抑制了
NSCLC細胞的增殖，但增加了凋亡潛能，反之亦然（圖4C-E）。
?HLF參與了癌細胞生長培養基的營養代謝，這是HLF抑制NSCLC細胞生長的前提條件。
?在低營養條件下觀察NSCLC細胞HLF對葡萄糖、脂肪酸和蛋白質的影響。如補充圖6A，HLF表達的改變並不影響總蛋白含量。然而，HLF的上調降低了葡萄糖、甘油三酯的消耗和乳酸的分泌，但增加了遊離脂肪酸的水平(圖4F–I)。
?矛盾的是，上調HLF增加了細胞內ATP的總產生和LDH的活性(補充圖6B和C）。這些發現表明，在低營養條件下，過表達HLF的癌細胞更容易發生有氧代謝而不是厭氧代謝，這進一步支持了上調HLF降低乳酸脫氫酶(LDH)的活性，厭氧糖酵解限速酶，一些厭氧糖酵解和乳酸發酵相關基因，但增強了多個三羧酸循環相關基因(。
?相反，沉默HLF則表現出相反的代謝特性，促進了NSCLC細胞的厭氧代謝(圖4F-I和補充圖6C和D)。上訴結果表明，低表達HLF促進非小細胞肺癌細胞的厭氧代謝。
?事實上，即使在氧含量正常的情況下，癌細胞也表現出葡萄糖代謝特徵的改變，更傾向於無氧代謝，這一現象被稱為「瓦伯格效應」。綜上所述，我們的結果表明，低表達HLF可促進NSCLC細胞從三羧酸循環向厭氧代謝的首選代謝途徑的轉換，從而進一步促進細胞在低營養條件下的生長。
?為了進一步確定低營養條件下HLF抑制NSCLC生長和轉移的潛在機制，我們將多個信號通路的熒光素酶報告質粒轉染到NSCLC細胞中。如圖5A所示，上調HLF顯著增強了NSCLC細胞PPAR信號活性，抑制了NF-κB信號活性;相反，沉默HLF則產生相反的效果(圖5A)。
?基於TCGA的NSCLC數據集中HLF的表達進行了基因集富集分析(GSEA)，結果顯示HLF的表達水平與PPAR信號呈正相關，而與NF-κB信號呈負相關。根據GSEA分析，HLF表達與脂質氧化和糖酵解顯著相關(補充圖6F)。
?重要的是，一些證據表明，HLF通過增加脂解誘導的遊離脂肪酸積累，參與PPAR的易位和激活，通過破壞p65與靶DNA的結合，NF-κB信號通路廣泛參與了癌症的進展和轉移。PPAR信號通路由PPARα、PPARβ/δ和PPARγ等幾個家族成員組成。因此，確定參與HLF抑制NF-κB信號通路以及NSCLC腫瘤發生和轉移的特異性PPAR成員至關重要。
?首先，檢測10對NSCLC組織中PPARα、PPARβ/δ和PPARγ的表達水平。如補充圖6G和H，PPARα在4/10對組織中表達顯著下調，PPARγ在8/10對表達，而PPARβ/δ在8/10對組織中表達上調。已有廣泛報道稱PPARα和PPARγ在NSCLC中起腫瘤抑制信號的作用，而據報道PPARβ/δ對起致癌作用。
?Westernblot分析一致顯示，HLF的上調增加了PPARα和PPARγ的總表達和核易位，增加了IκBα的表達，但降低了磷酸化的NF-κB和p65的總水平和核水平。相反，沉默HLF則發揮了相反的作用。因此，我們的研究結果表明，HLF在NSCLC中激活PPARα和PPARγ，抑制NF-κB/p65信號通路。
?我們使用PPARα激動劑非諾貝特、PPA
Rγ激動劑吡格列酮和NF-κB信號抑製劑LY2409881，進一步研究了PPARα/PPARγ/NF-κB/p65信號軸在HLF在NSCLC細胞中的功能作用中的意義。
?我們的結果顯示，在HLF沉默的細胞中，非諾貝特和吡格列酮顯著上調了PPAR的活性，而LY2409881則沒有上。
?然而，非諾貝特、吡格列酮和LY2409881差異降低了HLF沉默細胞中NF-κB信號的活性。
?重要的是，非諾貝特、吡格列酮和LY2409881減弱了HLF下調對細胞非錨定生長和抗缺氧能力的刺激作用。相反，非諾貝特、吡格列酮和LY2409881逆轉了低營養條件下HLF下調對NSCLC細胞的促增殖（克隆生長）和抗凋亡作用