七百七十五.反制措施
儘管最近在晚期或轉移性非小細胞肺癌的治療方面取得了進展，但遠處轉移仍然是癌症相關死亡的主要原因和實現長期生存的障礙。遠處轉移是各種實體腫瘤發展的一個不祥的特徵和最終結果，包括NSCLC。從腫瘤起源到播散的腫瘤細胞在遠處器官的定植是一個多步驟但效率低下的過程。雖然我們對遠處轉移所涉及的細胞和分子機制有了很好的了解，但不同轉移到原發腫瘤的遺傳分化和系統發育關係仍然很大程度上是不確定的。
新的證據表明，腫瘤的發展可以被認為是一個不斷進化的達爾文模型。轉移也可以被看作是腫瘤細胞通過微觀和/或宏觀進化轉移從原發灶擴散到轉移的進化過程。與經典的轉移只有在腫瘤形成的後期才出現的觀點不同，最近的研究表明這一過程可能發生在腫瘤形成的早期。為了系統地闡述這一過程，提出了兩個一般的進展模型，即線性進展模型和平行進展模型。
這兩種模式從兩個維度加以區分：(1)原發灶出現轉移的相對時間；(2)預期的遺傳分化，特徵是比較原發灶和匹配的轉移灶之間突變的總和。儘管最近對原發腫瘤和轉移灶的比較研究表明，不同類型的癌症可能同時存在線性和平行的轉移進展，但目前尚不清楚癌症不同器官部位的轉移是遵循相同還是不同的進展模式。此外，受癌症影響的同一轉移器官的轉移內和轉移間的異質性仍未完全闡明。對這些問題的更好理解不僅將為轉移過程的生物學提供新的見解，而且還將有可能揭示同時針對原發腫瘤和轉移腫瘤的治療策略的差異。
為了全面探討肺腺癌最常見的兩種轉移方式--肝轉移瘤(LiM)和腦轉移瘤(BrM)的遺傳差異和親緣關係，我們對10例原發腫瘤(LIM-P)和肝轉移瘤(LIM-M)、11例原發腫瘤(BRM-P)和腦轉移瘤(BRM-M)的63例組織和血液標本進行了全外顯子測序(WES)。為了保證腫瘤的自然進化狀態，在任何系統治療之前，都會將符合條件的組織和外周血液樣本進行匹配。此外，我們還收集了另外16份手術樣本和5例僅有BRMS的肺腺癌患者的配對外周血液，並對其進行了測序。我們的目標包括：(1)確定肺腺癌的LIM和BRM在其原發瘤的單核苷酸變異(SNV)和拷貝數變異(CNV)方面是否有不同的突變景觀；(2)比較LIM和BRM的進化模式；(3)表徵BRM的轉移內和轉移間的異質性。
最典型的突變驅動基因包括28例(66.7%)樣本中的TP53(15例/23例)和12例(28.6%)樣本中的EGFR突變(6例/23例)(圖1A)。值得注意的是，TP53和EGFR突變在匹配的原發腫瘤和轉移腫瘤之間高度一致。
為了研究腫瘤間的異質性，已識別的基因改變被分類為共享的(存在於原發和轉移腫瘤中)或私有的(僅存在於原發和轉移的腫瘤中)突變。23我們觀察到LIM隊列中腫瘤間的同質性明顯更高，被鑒定為共享的基因突變的中位數為66.3%(範圍為6.1%-97.1%)。這與BRM隊列中發現的6.8%(範圍為0.0%-30.5%)共享基因突變的中位數形成鮮明對比。
LIM-P和LIM-M之間的TMB相似(p>0.999)。
然後，
我們利用皮爾遜相關分析計算突變相似度，以描述配對的原發腫瘤和轉移腫瘤之間突變特徵的一致性和差異性。如圖1E和1F所示，我們觀察到LIM組LIM-P和LIM-M之間的突變一致性較高，而BRM組BRM-P和BRM-M之間的突變一致性有限。統計分析表明，LIM組突變相似性的皮爾遜相關系數顯著高於BRM組(p=0.019)。
我們用皮爾遜相關分析研究了配對的原發瘤和轉移瘤之間CNV分佈的不一致性。結果顯示，LIM-P和LIM-M之間的CNV模式高度相似，10例中有9例(90.0%)的Pearson相關系數大於0.8。然而，配對的BRM-P和BRM-M之間的CNVS模式高度不一致，11例中只有4例(36.4%)的Pearson相關系數大於0.8。統計分析表明，LIM組的CNV相似性顯著高於BRM組(p=0.035)。
總共有42條通路在這些樣本中顯著富集，與LIM-P相比，LIM-M具有獨特的顯著豐富的轉移相關通路，如Notch信號和ECM-受體相互作用。Notch信號也在BRM-M中豐富，但在BRM-P中不豐富。並且，BRM-M，還有許多
獨特的途徑，如藥物代謝、幾種免疫相關途徑、細胞凋亡和錯配修復。為了了解BRM-P和BRM-M中的通路水平相似性是否也比LIM-P和LIM-M中的降低，我們進行了通路特徵分析，並計算了樣本組之間的通路水平相似性(參見材料和方法)。事實上，與它們相匹配的原發腫瘤相比，BRM-M有明顯不同的途徑富集，而LIM-M有更多相似的通路。(p=0.0011)。
2.配對原發和轉移性腫瘤的系統發育關係
為了研究LIM和BRM的進化過程(例如，線性與平行發展模型4)，我們研究了原發腫瘤和它們匹配的轉移瘤之間的系統發育關係。我們推斷了基因組改變的序列，然後使用兩種獨立的演演算法重建了每種情況下的系統發育樹。我們在圖3A中列出了每組的三個有代表性的案例。
3.配對BRM的轉移內和轉移間同質性
由於BRM在配對的原發灶和轉移灶之間表現出明顯低於LIM組的突變和拷貝數變異相似性，因此我們隨後研究了BRM的轉移內和轉移間的異質性。我們採用了如前所述的方法研究BRM的轉移內(單個BRM的多個區域)和轉移間(來自同一患者的多個BRM)的異質性，24例，並收集了另外5例肺腺癌患者的BRM標本。如圖4所示，單個BRM病灶被分成來自患者BrM91、BrM93和BrM94的三到四個部分，用於轉移內分析。為了進行轉移間異質性分析，分別從患者BrM95和BrM96收集了3個和2個BRM病灶。這些樣本中最典型的突變驅動基因是EGFR和TP53。同樣，轉移內和轉移間的樣本中EGFR突變是完全一致的。
同一患者的所有樣本的突變模式和特徵幾乎一致(圖4A)。此外，我們還重建了每個病例的系統發育樹。如圖4B所示，所有病例的不同轉移樣本都可以追溯到單系關係，這表明多個BRMS的共同起源是佔優勢的。
?討論?
儘管最近在各種癌症的治療方面取得了進展，但科學發現尚未有效地轉化為預防和治療轉移，這仍然是治療失敗和令人沮喪的長期生存的主要挑戰。越來越多的證據表明，轉移在一定程度上是原發腫瘤進化的產物。轉移能力強的克隆可能出現在原發腫瘤進展的早期和晚期。更好地了解轉移過程及其進展模式被認為具有重要的臨床意義；因此，這些發現最終可能導致預防和控制遠處轉移的新策略。此外，闡明不同轉移部位的獨特突變格局和進化模式可能有助於為臨床上這一未得到滿足的需求制定精確的策略。
為了達到這一目標，我們對21例患有LIM或BRM的肺腺癌進行了WES，以研究它們的突變格局和進化模式。此外，我們還對另外5個單發BRMS進行了多區域WES檢查，以探討轉移內或轉移間的異質性。我們的研究發現，與原發腫瘤相比，BRM-M呈現出比LIM-M更不同的突變格局。BRM和LIM的肺腺癌發生髮展軌跡完全不同。BRM更有可能有一個并行進化模型，而LIM更有可能有一個線性模型。最後，我們發現在BRM-M中轉移間和轉移內的同質性很普遍。
我們首先在SNV水平上研究了LIM和BRM的突變情況。雖然原發腫瘤與匹配的LIM-M或BRM-M在突變模式和突變特徵上沒有太大差異，但我們確實注意到BRM-M具有更高比例的特異體細胞突變，這表明BRM-M與LIM-M相比在遺傳學上與其原發腫瘤的差異更大。由於SNV的局限性，我們進一步觀察了CNV的模式。然而LIM-M與原發腫瘤的高度一致性被注意到，而BRM組沒有觀察到這樣的發現。此外，BRM-M的CNV水平明顯高於LIM-M。鑒於CNV是染色體不穩定(CIN)的一個重要指標，而且以前的文獻表明CIN與轉移有關，CIN在BRM的形成和發展中的重要作用值得進一步研究。最近，Shih等人報道了MYC、YAP1或MMP13的過表達可能會增加BRM的發生率，這表明對足夠數量的轉移腫瘤進行基因組測序可以找到以前未知的轉移驅動因素。總而言之，這些發現使得我們有理由認為，向不同器官發起轉移的克隆可能遵循不同的進化路徑。這確實讓人想起蘭伯特等人。陳述轉移能力不是原發腫瘤進展的偶然結果，而是在原發腫瘤進化過程中選擇的性狀，以及經典的「種子和土壤」假說。
早期對不同癌症的研究，包括乳腺癌和結直腸癌，顯示出原發腫瘤和轉移腫瘤之間的高度一致性，表明了線性進展模型。這些結果達成了一種觀點
，即使用原發腫瘤的測序數據來指導轉移病變的治療。然而，最近的一項研究對這一範式提出了挑戰，該研究發現有轉移能力的克隆在原發前列腺癌和轉移癌中的早期擴散和平行進展。類似地，趙等人報告了對原發腫瘤和轉移瘤(包括13例肺癌)，並發現有11例遵循平行進展。類似地，趙等人9報告了40對原發腫瘤和轉移瘤(包括13例肺癌)，並發現11例遵循平行進展。此外，Hosseini等人發現，超過80%的轉移來自早期播散的乳腺癌細胞，而那些早期播散的癌細胞比後期播散的癌細胞更具轉移能力。因此，這些結果表明，在癌症演變過程中，平行和線性進展模式並存。在這項研究中，我們發現線性進展模型在LIM中的優勢，而平行進展模型在BRM中的優勢，提出了結合轉移灶，特別是BRM的遺傳信息來指導這些患者更好的量身定製治療的必要性。
最後，我們對BRM的轉移內和轉移間異質性進行了初步分析。儘管樣本量很小，但我們觀察到了轉移內和轉移間的同質性，正如之前報道的那樣。在同一患者的不同BRM病變中，發現驅動基因改變、突變模式和突變特徵幾乎是一致的。同時，系統發育分析表明，所有腫瘤標本，無論來自相同或不同的轉移部位，都可以追溯到單系關係，這表明多個BRMS存在共同起源。此外，我們還觀察了單個轉移灶和不同BRM病灶內不同的分歧時間點。因此，我們推測BRM可能真的存在微小的微進化轉變，目前尚不清楚其生物學功能。綜上所述，我們的研究進一步強調了BRM進化的複雜性和獨特性。
綜上所述，我們的研究揭示了同一原發腫瘤轉移到不同器官部位可能有不同的突變景觀和進化軌跡。這些發現將為轉移過程的生物學提供新的見解，並為開發預防和靶向遠處轉移的新方法提供有用的信息。
這項研究的發現可能有幾個臨床意義。首先，我們觀察到LIM和BRM隊列中驅動基因(如TP53和EGFR)功能突變的同質性。這與最近對未經治療的癌症的遺傳異質性的分析一致，該分析還發現，來自同一原發腫瘤的轉移瘤中100%的驅動程序突變是同質的，這表明成對的原發和轉移病變之間功能驅動程序基因突變的高度同質性。其次，對於LIM患者，LIM-M的突變情況與其匹配的原發腫瘤高度相似，這表明在描繪突變特徵時，原發腫瘤對LIM-M的可替換性。然而，由於BRM-M更有可能有一個平行的進化模式，我們應該意識到，在給定的臨床環境下，通過對原發腫瘤進行一次活檢確定的可操作突變可能不代表BRM-M的突變。第三，空間上分離的腦轉移灶在基因上是同質的，BRM-M的分支突變比例明顯更高，這表明腦轉移瘤譜系的額外進化。針對腦轉移瘤的靶向性改變代表着新的靶向治療策略克服治療耐藥性的重要機會，並將影響總體生存。第四，肺腺癌LIM和BRM之間存在着不同的突變格局和進化模式，這意味着需要採取精確的策略來治理這兩個不同的轉移病灶，同時也提出了一個問題，即研究其他常見轉移病灶(如骨和腎上腺轉移)的進化模式。